Proteinasa K mNGS (líquid)
La proteinasa K és una serina proteasa estable amb una àmplia especificitat de substrat.Degrada moltes proteïnes en estat natiu fins i tot en presència de detergents.L'evidència d'estudis d'estructura molecular i cristal·lina indiquen que l'enzim pertany a la família de la subtilisina amb una tríada catalítica del lloc actiu (Asp39-Seva69- Ser224).El lloc predominant d'escissió és l'enllaç peptídic adjacent al grup carboxil d'aminoàcids alifàtics i aromàtics amb grups alfa amino bloquejats.S'utilitza habitualment per la seva àmplia especificitat.Aquesta proteinasa K està especialment dissenyada per a mNGS.En comparació amb l'altra proteinasa K, conté encara menys contaminació d'àcids nucleics amb el mateix rendiment enzimàtic, cosa que podria assegurar millor l'aplicació mNGS aigües avall.
Condicions d'emmagatzematge
2-8 ℃ durant 2 anys
Especificació
| Aparença | Líquid incolor a marró clar |
| Activitat | ≥800 U/ml |
| Concentració de proteïnes | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Cap detectat |
| DNasa | Cap detectat |
| RNasa | Cap detectat |
Propietats
| Número CE | 3.4.21.64(Recombinant de l'àlbum Tritirachium) |
| Punt isoelèctric | 7,81 |
| pH òptim | 7,0- 12,0 Fig. 1 |
| Temperatura òptima | 65 ℃ Fig. 2 |
| estabilitat del pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Estabilitat tèrmica | Per sota de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Estabilitat d'emmagatzematge | Més del 90% d'activitat durant 12 mesos a 25 ℃ |
| Activadors | SDS, urea |
| Inhibidors | fluorofosfat de diisopropil;fluorur de fenilmetilsulfonil |
Aplicacions
1. Kit de diagnòstic genètic
2. Kits d'extracció d'ARN i DNA
3. Extracció de components no proteics dels teixits, degradació d'impureses proteiques, com l'ADNvacunes i preparació d'heparina
4. Preparació d'ADN cromosòmic mitjançant electroforesi polsada
5. Western blot
6. Reactius d'albúmina glicosilada enzimàtica Diagnòstic in vitro
Precaucions
Utilitzeu guants i ulleres de protecció durant l'ús o el pes, i manteniu-lo ben ventilat després de l'ús.Aquest producte pot causar reaccions al·lèrgiques a la pell i irritació ocular greu.Si s'inhala, pot causar símptomes d'al·lèrgia o asma o dispnea.Pot causar irritació respiratòria.
Definició de la unitat
Una unitat (U) es defineix com la quantitat d'enzim necessària per hidrolitzar la caseïna per produir 1 μmoltirosina per minut en les condicions següents.
Preparació de reactius
Reactiu I: 1 g de caseïna de llet es va dissoldre en 50 ml de solució de fosfat de sodi 0,1 M (pH 8,0), es va incubar en aigua a 65-70 ℃ durant 15 minuts, es va agitar i es va dissoldre, es va refredar amb aigua, es va ajustar amb hidròxid de sodi a pH 8.0 i un volum fix. 100 ml.
Reactiu II: àcid tricloroacètic 0,1 M, acetat de sodi 0,2 M, àcid acètic 0,3 M.
Reactiu III: 0,4 M Na2CO3solució.
Reactiu IV: reactiu de forint diluït amb aigua pura 5 vegades.
Reactiu V: Diluent enzimàtic: solució de fosfat de sodi 0,1 M (pH 8,0).
Reactiu VI: solució de tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de tirosina dissolta amb 0,2M HCl.
Procediment
1. S'escalfa prèviament 0,5 ml de reactiu I a 37 ℃, afegiu 0,5 ml de solució enzimàtica, barregeu bé i s'incube a37 ℃ durant 10 minuts.
2. Afegiu 1 ml de reactiu II per aturar la reacció, barregeu bé i continueu la incubació durant 30 minuts.
3. Centrifugar la solució de reacció.
4. Agafeu 0,5 ml de sobrenedant, afegiu 2,5 ml de reactiu III, 0,5 ml de reactiu IV, barregeu bé i incubeu a 37 ℃durant 30 minuts.
5. OD660es va determinar com a OD1;Grup de control en blanc: 0,5 ml de reactiu V s'utilitza per substituir l'enzimsolució per determinar el DO660com OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Corba estàndard de L-tirosina: solució de L-tirosina de concentració diferent de 0,5 ml, reactiu III de 2,5 ml, reactiu IV de 0,5 ml en tub de centrífuga de 5 ml, incubar a 37 ℃ durant 30 minuts, detectar OD660per a diferents concentracions de L-tirosina, s'obté la corba estàndard Y=kX+b, on Y és la concentració de L-tirosina, X és OD600.
Càlcul
2: volum total de solució de reacció (ml)
0,5: volum de solució enzimàtica (ml)
0,5: volum de líquid de reacció utilitzat en la determinació cromogènica (mL)
10: Temps de reacció (min)
Df: Dilució múltiple
C: Concentració enzimàtica (mg/ml)
Referències
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U i Hilz H. Biochem.Biofísica.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edició, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Xifres
Fig.1 Òptima pH
Solució tampó 100 mM: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glicina-NaOH. Concentració d'enzim: 1 mg/mL
Fig.2 Temperatura òptima
Reacció en tampó K-fosfat 20 mM pH 8,0.Concentració enzimàtica: 1 mg/mL
Fig.3 pH Estabilitat
25 ℃, 16 h de tractament amb solució tampó 50 mM: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicina-NaOH.Concentració enzimàtica: 1 mg/mL
Fig.4 Tèrmica estabilitat
Tractament de 30 min amb tampó Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentració enzimàtica: 1 mg/mL
Fig.5 Emmagatzematge establety at 25℃
