Proteinasa K (pols liofilitzat)
Cat No: HC4500A
La proteinasa K és una serina proteasa estable amb una àmplia especificitat de substrat.Degrada moltes proteïnes en estat natiu fins i tot en presència de detergents.L'evidència d'estudis d'estructura molecular i cristal·lina indiquen que l'enzim pertany a la família de la subtilisina amb una tríada catalítica del lloc actiu (Asp39-Seva69- Ser224).El lloc predominant d'escissió és l'enllaç peptídic adjacent al grup carboxil d'aminoàcids alifàtics i aromàtics amb grups alfa amino bloquejats.S'utilitza habitualment per la seva ampleespecificitat.
Condicions d'emmagatzematge
2-8 ℃ emmagatzematge a curt termini, -25 ~ -15 ℃ emmagatzematge a llarg termini.Estat de pols seca -25 ~ -15 ℃ vàlid durant 3 anys;la pols d'enzim s'ha de dissoldre en el volum adequat.
Especificació
| Aparença | Pols liofilitzat amorf de color blanc a blanquinós |
| Activitat | ≥30 U/mg |
| DNasa | Cap detectat |
| RNasa | Cap detectat |
Propietats
| Número CE | 3.4.21.64 (Recombinant de l'àlbum Tritirachium) |
| Pes molecular | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Punt isoelèctric | 7,81 |
| pH òptim | 7,0-12,0 Fig.1 |
| Temperatura òptima | 65 ℃ Fig.2 |
| estabilitat del pH | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) Fig.3 |
| Estabilitat tèrmica | Per sota de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig.4 |
| Activadors | SDS, urea |
| Inhibidors | fluorofosfat de diisopropil;fluorur de fenilmetilsulfonil |
Aplicacions
1. Kit de diagnòstic genètic
2. Kits d'extracció d'ARN i DNA
3. Extracció de components no proteics dels teixits, degradació d'impureses proteiques, com ara vacunes d'ADN i preparació d'heparina
4. Preparació d'ADN cromosòmic mitjançant electroforesi polsada
5. Western blot
6. Reactius d'albúmina glicosilada enzimàtica Diagnòstic in vitro
Precaucions
Utilitzeu guants i ulleres de protecció durant l'ús o el pes, i manteniu-lo ben ventilat després de l'ús.Aquest producte pot causar reaccions al·lèrgiques a la pell i irritació ocular greu.Si s'inhala, pot causar símptomes d'al·lèrgia o asma o dispnea.Pot causar irritació respiratòria.
Assaig
Definició de la unitat
Una unitat (U) es defineix com la quantitat d'enzim necessària per hidrolitzar la caseïna per produir 1 μmol de tirosina per minut en les condicions següents.
Preparació de reactius
Reactiu I: 1 g de caseïna de llet es va dissoldre en 50 ml de solució de fosfat de sodi 0,1 M (pH 8,0), es va incubar en aigua a 65-70 ℃ durant 15 minuts, es va agitar i es va dissoldre, es va refredar amb aigua, es va ajustar amb hidròxid de sodi a pH 8.0 i un volum fix. 100 ml.
Reactiu II: àcid tricloroacètic 0,1 M, acetat de sodi 0,2 M, àcid acètic 0,3 M.
Reactiu III: 0,4 M Na2CO3solució.
Reactiu IV: reactiu de forint diluït amb aigua pura 5 vegades.
Reactiu V: diluent enzimàtic: solució de fosfat sòdic 0,1 M (pH 8,0).
Reactiu VI: solució de tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de tirosina dissolta amb HCL 0,2M.
Procediment
1. S'escalfa prèviament 0,5 ml de reactiu I a 37 ℃, afegiu 0,5 ml de solució enzimàtica, barregeu bé i s'incube a 37 ℃ durant 10 minuts.
2. Afegiu 1 ml de reactiu II per aturar la reacció, barregeu bé i continueu la incubació durant 30 minuts.
3. Centrifugar la solució de reacció.
4. Agafeu 0,5 ml de sobrenedant, afegiu-hi 2,5 ml de reactiu III, 0,5 ml de reactiu IV, barregeu bé i incubeu a 37 ℃ durant 30 minuts.
5. OD660es va determinar com a OD1;Grup de control en blanc: 0,5 ml de reactiu V s'utilitza per substituir la solució enzimàtica per determinar la DO660com OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Corba estàndard de L-tirosina: solució de tirosina L de concentració diferent de 0,5 ml, reactiu III de 2,5 ml, reactiu IV de 0,5 ml en tub de centrífuga de 5 ml, incubar a 37 ℃ durant 30 minuts, detectar OD660per a diferents concentracions de L-tirosina, s'obté la corba estàndard Y=kX+b, on Y és la concentració de L-tirosina, X és OD600.
Càlcul
2: volum total de solució de reacció (ml)
0,5: volum de solució enzimàtica (ml)
0,5: volum de líquid de reacció utilitzat en la determinació cromogènica (mL)
10: Temps de reacció (min)
Df: Dilució múltiple
C: Concentració enzimàtica (mg/ml)
Referències
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U i Hilz H. Biochem.Biofísica.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edició, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Fig. 2 Temperatura òptima
Reacció en tampó K-fosfat 20 mM pH 8,0.Concentració enzimàtica: 1 mg/ml
Fig. 3 pH Estabilitat
25 ℃, 16 h de tractament amb solució tampó de 50 mM: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.pH 9,0-12,5, glicina-NaOH.Concentració enzimàtica: 1 mg/ml
Fig. 4 Tèrmica estabilitat
Tractament de 30 min amb tampó Tris-HCL 50 mM, pH 8,0.Concentració enzimàtica: 1 mg/ml
Fig. 5 Emmagatzematge establety at 25℃
