5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Cat No: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) és una barreja d'un tub basat en sonda molt estable adequada per a la transcripció inversa d'un sol pas i la PCR quantitativa (qRT-PCR).Admet la premescla d'encebadors i sondes i es manté estable després d'emmagatzemar molt de temps a baixa temperatura.La mostra que s'ha de provar es pot afegir directament quan s'utilitza, sense operació addicional d'obertura del tub/pipetat.Aquest producte proporciona components, per exemple, ADN polimerasa d'arrencada en calent, M-MLV, ADN glicosilasa d'uracil tèrmic (TS-UNG), inhibidor de RNasa, MgCl2, dNTP (amb dUTP en lloc de dTTP) i estabilitzadors.Amb la transcriptasa inversa d'amplificació ràpida modificada genèticament i l'ADN polimerasa, és possible completar l'amplificació per PCR en 20-40 minuts.Aquest reactiu utilitza un tampó especial per a qPCR amb enzims mixts d'enzim d'amplificació antiinhibidor i enzim UNG.Per tant, pot obtenir una bona amplificació dels gens diana i prevenir l'amplificació falsa causada per la contaminació residual de PCR i aerosol.Aquest reactiu és compatible amb la majoria d'instruments de PCR quantitatius de fluorescència de fabricants com Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad i Roche.
Component
1.25 × Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Condicions d'emmagatzematge
Tots els components s'han de mantenir a -20 ℃ per a l'emmagatzematge a llarg termini i 4 ℃ fins a 3 mesos.Si us plau, barrejar bé després de descongelar i centrifugar abans d'utilitzar.Eviteu la congelació-descongelació freqüent.
Preparació del sistema de reacció qRT-PCR
| Components | 25μLSistema | 50μLSistema | Concentració final |
| 5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μl | 10μl | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μl | 2μl | 1× |
| 25 × mescla imprimació-sondaa | 1μl | 2μl | 1× |
| Plantilla RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Fins a 25μL | Fins a 50μL | – |
1) a.La concentració final d'imprimació sol ser de 0,2μM.Per obtenir millors resultats, la concentració d'imprimació es pot optimitzar dins del rang de 0,2-1μM.En general, la concentració de la sonda es pot optimitzar dins del rang de 0,1-0,3μM.
2) b. Quan s'utilitza un procediment de PCR ràpid, augmentar la concentració d'encebadors i sondes pot donar lloc a millors resultats d'amplificació, i la seva proporció s'ha d'optimitzar en conseqüència.
3) Els diferents tipus de mostres contenen diferents tipus i contingut d'inhibidor i nombre de còpia del gen objectiu.El volum de la mostra s'ha de considerar segons les condicions reals.Feu una dilució de la mostra amb aigua lliure de nucleases o tampó TE, si cal.
Reacció Ccondicions
| Procediment de PCR habitual | Procediment ràpid de PCR | ||||||
| Procediment | Temp. | Temps | Cicle | Procediment | Temp. | Temps | Cicle |
| Transcripció inversa | 50℃ | 10-20 minuts | 1 | Transcripció inversa | 50℃ | 5 minuts | 1 |
| Polimerasa Activació | 95℃ | 1-5 minuts | 1 | Polimerasa Activació | 95℃ | anys 30 | 1 |
| Desnaturalització | 95℃ | 10-20 anys | 40-50 | Desnaturalització | 95℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Recuit i Extensió | 56-64 ℃ | Anys 20-60 | Recuit i Extensió | 56-64 ℃ | 3-20 anys | ||
Control de qualitat
1.Detecció de funcions: sensibilitat, especificitat i repetibilitat de la qPCR.
2.No hi ha activitat nucleasa exògena: no hi ha contaminació d'endonucleases i exonucleases exògenes.
Notes
1.La taxa d'amplificació de l'ADN polimerasa ràpida no és inferior a 1 kb/10s.Els diferents instruments de PCR tenen diferents velocitats d'escalfament i refrigeració, modes de control de temperatura i conductivitat tèrmica i, per tant, l'optimització de la concentració d'imprimació/sonda i el mètode d'execució en combinació amb el vostre instrument de PCR ràpid específic és essencial.
2.Aquest producte té una àmplia aplicabilitat i és adequat per al diagnòstic molecular d'alta sensibilitat.Es recomana el mètode de PCR de tres passos per a cebadors amb baixa temperatura de recuit o per a l'amplificació de fragments llargs de més de 200 pb.
3.Com que els diferents amplicons tenen una eficiència d'utilització diferent del dUTP i una sensibilitat diferent a UNG, els reactius s'han d'optimitzar si la sensibilitat de detecció disminueix quan s'utilitza el sistema UNG.Si us plau, poseu-vos en contacte amb nosaltres per obtenir suport tècnic si cal.
4.Per evitar l'amplificació dels productes de PCR de transferència, es requereix una àrea experimental dedicada i una pipeta per a l'amplificació.Funcioneu amb guants i canvieu-los amb freqüència i no obriu el tub de PCR després de l'amplificació.
