Proteinasa K NGS (en pols)
Cat No: HC4507A
NGS Protease K és una serina proteasa estable amb una alta activitat enzimàtica i una àmplia especificitat de substrat. L'enzim descompon preferentment enllaços èster i enllaços peptídics adjacents al terminal C d'aminoàcids hidrofòbics, aminoàcids que contenen sofre i aminoàcids aromàtics.Per tant, sovint s'utilitza per degradar proteïnes en pèptids curts.NGS Protease K és una serina proteasa típica amb Asp39-Seva69- Ser224tríada catalítica que és exclusiva de les serina proteases, i el centre catalític està envoltat per estopa Ca2+llocs d'unió per a l'estabilització, mantenint una alta activitat enzimàtica en una gamma més àmplia de condicions.
Especificació
| Aparença | Pols amorfa de color blanc a blanquinós, liofilitzat |
| Activitat específica | ≥40U/mg sòlid |
| DNasa | Cap detectat |
| RNasa | Cap detectat |
| Biocàrrega | ≤50 CFU/g sòlid |
| Residus d'àcid nucleic | <5pg/mg sòlid |
Propietats
| Font | Àlbum Tritirachium |
| Número CE | 3.4.21.64(Recombinant de l'àlbum Tritirachium) |
| Pes molecular | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Punt isoelèctric | 7.81 Fig.1 |
| pH òptim | 7,0-12,0 (Tots fan una activitat elevada) Fig.2 |
| Temperatura òptima | 65℃ Fig.3 |
| Estabilitat del pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Estabilitat tèrmica | Per sota de 50℃ (pH 8,0, 30min) Fig.5 |
| Estabilitat d'emmagatzematge | Emmagatzemat a 25 ℃ durant 12 mesos Fig.6 |
| Activadors | SDS, urea |
| Inhibidors | fluorofosfat de diisopropil;fluorur de bencilsulfonil |
Condicions d'emmagatzematge
Emmagatzemeu la pols liofilitzada a -25 ~ -15 ℃ durant molt de temps lluny de la llum;Després de la dissolució, una alícuota al volum adequat per a l'emmagatzematge a curt termini a 2-8 ℃ lluny de la llum o emmagatzematge a llarg termini a -25 ~ -15 ℃ lluny de la llum.
Precaucions
Utilitzeu guants i ulleres de protecció durant l'ús o el pes, i manteniu-lo ben ventilat després de l'ús.Aquest producte pot causar reaccions al·lèrgiques a la pell i irritació ocular greu.Si s'inhala, pot causar símptomes d'al·lèrgia o asma o dispnea.Pot causar irritació respiratòria.
Definició de la unitat
Una unitat de NGS Proteasa K es defineix com la quantitat d'enzim necessària per hidrolitzar la caseïna en 1 μmol de L-tirosina en condicions de determinació estàndard.
Preparació de reactius
| Reactiu | Fabricant | Catàleg |
| Caseïna tècnicade llet bovina | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Àcid tricloroacètic | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetat de sodi | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Àcid acètic | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Carbonat de sodi | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folina-fenol | Sangon Biotech (Xangai)Co, Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reactiu I:
Substrat: 1% de caseïna de solució de llet bovina: dissoldre 1 g de caseïna de llet bovina en 50 ml de solució de fosfat sòdic 0,1 M, pH 8,0, escalfar al bany maria a 65-70 ° C durant 15 minuts, remenar i dissoldre, refredar amb aigua, ajustat per hidròxid de sodi a pH 8,0 i diluir a 100 ml.
Reactiu II:
Solució de TCA: àcid tricloroacètic 0,1 M, acetat de sodi 0,2 M i àcid acètic 0,3 M (peseu 1,64 g d'àcid tricloroacètic + 1,64 g d'acetat de sodi + 1,724 ml d'àcid acètic successivament, afegiu 50 ml d'aigua desionitzada, ajusteu el pH amb HCl 4.0l). 100 ml).
Reactiu III:
Solució de carbonat de sodi de 0,4 m (pesar 4,24 g de carbonat de sodi anhidre i dissoldre en 100 ml d'aigua)
Reactiu IV:
Reactiu de folin fenol: diluir 5 vegades amb aigua desionitzada.
Reactiu V:
Diluent enzimàtic: solució de fosfat de sodi 0,1 M, pH 8,0.
Reactiu VI:
Solució estàndard de L-tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosina dissolta amb HCl 0,2 M.
Procediment
1. Enceneu l'espectrofotòmetre UV-Vis i seleccioneu la mesura fotomètrica.
2. Estableix la longitud d'ona com a 660 nm.
3. Enceneu el bany maria, ajusteu la temperatura a 37 ℃ i assegureu-vos que la temperatura no canviï durant 3-5 minuts.
4. Preescalfeu 0,5 ml de substrat en un tub de centrífuga de 2 ml al bany maria a 37 ℃ durant 10 minuts.
5. Extraieu 0,5 ml de solució enzimàtica diluïda al tub de centrífuga preescalfat durant 10 minuts.Estableix el diluent enzimàtic com a grup en blanc.
6. Afegiu 1,0 ml de reactiu TCA immediatament després de la reacció.Barrejar bé i incubar al bany maria durant 30 minuts.
7. Centrifugar la solució de reacció.
8. Afegiu els components següents en l'ordre especificat.
| Reactiu | Volum |
| Sobrenedant | 0,5 ml |
| Carbonat de sodi 0,4 M | 2,5 ml |
| Reactiu de folin fenol | 0,5 ml |
9. Barrejar bé abans d'incubar al bany maria a 37 ℃ durant 30 minuts.
10. OD660es va determinar com a OD1;Grup de control en blanc: el diluent enzimàtic s'utilitza per substituir la solució enzimàtica per determinar la DO660com OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Corba estàndard de L-tirosina: solució de L-tirosina de concentració diferent de 0,5 ml, carbonat de sodi 2,5 ml 0,4 M, reactiu de fenol Folin 0,5 ml en tub de centrífuga de 5 ml, incubar a 37 ℃ durant 30 minuts, detectar per OD660per a una concentració diferent de L-tirosina, s'obté la corba estàndard Y=kX+b, on Y és la concentració de L-tirosina, X és OD600.
Càlcul
2: volum total de solució de reacció (ml)
0,5: volum de solució enzimàtica (ml)
0,5: volum de líquid de reacció utilitzat en la determinació cromogènica (mL)
10: Temps de reacció (min)
Df: Dilució múltiple
C: Concentració enzimàtica (mg/ml)
Xifres
Fig.1 Residus d'ADN
| Mostra | Av C4 | Àcid nucleic Recuperació (pg/mg) | Recuperació (%) | Nucleic total àcid ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O lliure d'ARN | Indeterminat | — | — | — |
Fig.2 pH òptim
Fig.3 Temperatura òptima
Fig.4 Estabilitat del pH
Fig.5 Estabilitat tèrmica
Fig.6 Estabilitat d'emmagatzematge a 25℃
