EndoFree Plasmid Maxi Kit
Aquest kit és adequat per a l'extracció de 150 a 300 ml de solució bacteriana cultivada durant la nit, utilitzant un mètode de lisi alcalina SDS millorat per lisar els bacteris.L'extracte brut es combina selectivament amb un únic eliminador d'endotoxines i es separa per centrifugació per eliminar les endotoxines.Aleshores, la membrana de gel de sílice s'uneix selectivament a l'ADN plasmidi de la solució en condicions d'alta sal i pH baix.A continuació, s'afegeix un tampó de rentat per eliminar les impureses i altres components bacterians.Finalment, s'utilitza un tampó d'elució de pH alt i baix en sal per eluir l'ADN plasmidi pur de la membrana de la matriu de silici.La membrana de gel de sílice utilitza una membrana d'adsorció especial i la diferència de quantitat d'adsorció entre la columna i la columna és molt petita i la repetibilitat és bona.No es requereix fenol, cloroform i altres reactius tòxics, ni tampoc els passos de precipitació d'etanol.Aquest kit es pot utilitzar per extreure ràpidament 0,2 -1,5 mg d'ADN plasmidi pur d'alta còpia, amb una taxa d'extracció del 80% -90%.El kit utilitza una fórmula de procés única que elimina l'endotoxina, el contingut d'endotoxina és extremadament baix i l'efecte de transfecció cel·lular és excel·lent.El plasmidi extret es podria utilitzar directament en digestió enzimàtica, PCR, transcripció in vitro, transformació, seqüenciació i altres experiments de biologia molecular.
Condicions d'emmagatzematge
La RNaseA s'ha d'emmagatzemar a -30 ~ -15 ℃ i transportar-se a ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger es pot emmagatzemar a 2 ~ 8 ℃ durant un mes, emmagatzemat a -30 ~ -15 ℃ per a un emmagatzematge a llarg terminii transportat a ≤0℃.
Altres components s'han d'emmagatzemar a temperatura ambient (15 ~ 25 ℃) i transportar-se a temperatura ambient.
Components
| Components | 10RXNS |
| RNasa A | 750 μl |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Eliminador d'endotoxines | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Tampó TB | 20 ml |
| Columnes FastPure DNA Maxi (cadascuna en un tub de recollida de 50 ml) | 10 |
| Tub de recollida sense endotoxines | 2 × 5 |
RNasaA:10 mg/ml, utilitzat per eliminar l'ARN.
Buffer P1:tampó de suspensió bacteriana, afegiu RNaseA al tampó P1 abans del primer ús.
Buffer P2:tampó de lisi bacteriana (que conté SDS/NaOH).
Buffer P4:tampó neutralitzant.
Eliminador d'endotoxines:eliminar eficaçment l'endotoxina de l'extracte de plasmidi brut.
Buffer PW:tampó de rentat, afegiu el volum d'etanol estipulat abans del primer ús.
Buffer TB:tampó d'elució.
Columnes FastPure DNA Maxi:Columnes d'adsorció d'ADN plasmidi.
Tubs de recollida 50 ml:tubs de recollida de filtrats.
Tub de recollida sense endotoxines:tubs de recollida d'ADN plasmidi.
Materials preparats
Etanol absolut, isopropanol, tubs de centrífuga de fons rodó de 50 ml i 50 ml sense endotoxinestubs de centrífuga.
Aplicacions
Aquest producte és adequat per a l'extracció a gran escala de plasmidis de 150 a 300 ml de solució bacterianacultivada durant la nit.
Procés d'experimentació
1. Agafeu 150-200 ml (no més de 300 ml) de solució bacteriana cultivada durant la nit i centrifugueu aunes 11.000 rpm (12.000 × g) durant 1 – 2 min.Descartar el sobrenedant i recollir els bacteris.
Δ Quan es recullen més de 50 ml de solució bacteriana, els bacteris es poden recollir afegint solució bacteriana, centrifugació, descartant el sobrenedant i altres passos al mateix tub de 50 ml per
múltiples vegades.
2. Afegiu 7,5 ml de tampó P1 (comproveu si s'ha afegit RNasaA al tampó P1) a la centrífugatub que conté bacteris i barrejar bé mitjançant vòrtex o pipeta.
Δ La resuspensió completa dels bacteris en aquest pas és fonamental per obtenir el rendiment, i no hi hauria d'haver agrupacions bacterianes després de la resuspensió.Si hi ha grups bacterians que no es barregen a fons, afectarà la lisi, donant lloc a un baix rendiment i puresa.Si la DO600 de la solució bacteriana és de 0,65, es recomana utilitzar 7,5 ml de tampó P1 quan s'extreu de 150 ml de solució bacteriana;quan OD600 és 0,75, s'han d'utilitzar 8 ml de Buffer P1 i els volums de Buffers P2 i P4 s'han de canviar en conseqüència.Si s'augmenta el volum de la solució bacteriana a 200 ml, es recomana queel volum dels buffers P1, P2 i P4 augmentarà proporcionalment.
3. Afegiu 7,5 ml de buffer P2 a la suspensió bacteriana del pas 2 i barregeu suaument amunt i avall durant 6-8vegades i incubar a temperatura ambient durant 4-5 min.
Δ Inverteixi suaument per barrejar bé.El vòrtex provocarà la fragmentació de l'ADN genòmic, donant lloc a fragments d'ADN genòmic al plasmidi extret.En aquest moment, la solució es torna viscosa i translúcida, mostrant que els bacteris han estat totalment lisats.La durada no ha de superar els 5 minuts per evitar la destrucció dels plasmidis.Si la solució no és clara, pot haver-hi massa bacterislisi incompleta, de manera que s'ha de reduir adequadament la quantitat de bacteris.
4. Afegiu 7,5 ml de tampó P4 a la suspensió bacteriana del pas 3 i inverteixi immediatament suaument 6-8 vegades per permetre que la solució neutralitzi completament el tampó P2.En aquest moment, hauria d'aparèixer un precipitat floculent blanc.Centrifugueu a més d'unes 11.000 rpm (12.000 × g) durant 10 - 15 min, pipeteu amb cura el sobrenedant en un nou tub de centrífuga de fons rodó de 50 ml (preparat per si mateix) i eviteuaspirar el precipitat blanc flotant.
Δ Afegiu el tampó P4 i inverteixi immediatament per barrejar bé.Deixeu reposar el tub fins que el precipitat blanc es distribueixi uniformement per tota la solució per evitar la producció de precipitació local que pugui afectar la neutralització.Si no hi ha un precipitat floculent blanc uniforme abans de la centrifugació i el sobrenedant no és clar després de la centrifugació, el tub es potcentrifugar durant 5 minuts més.
5. Afegiu 0,1 vegades el volum (10% del volum del sobrenedant, uns 2,2 ml) d'Endotoxin Scavenger al sobrenedant del pas 4 i inverteix-lo per barrejar.Col·loqueu la solució en un bany de gel o introduïu-la en gel picat (o congelador) durant 5 minuts fins que la solució canviï de tèrbol a clar i transparent (o encaralleugerament tèrbol), i de tant en tant es barregen diverses vegades.
Δ Després d'afegir l'Endotoxin Scavenger al sobrenedant, el sobrenedant es tornarà tèrbol, però elEl sobrenedant ha de quedar clar (o lleugerament tèrbol) després de refredar-se al bany de gel.
6. Després de col·locar el sobrenedant a temperatura ambient (>25 ℃) durant 10 – 15 min, es tornarà tèrbol a mesura quela seva temperatura augmenta fins a la temperatura ambient.Aleshores, el sobrenedant s'ha d'invertir per barrejar-lo.
Δ Si la temperatura ambient és més baixa o voleu reduir el temps d'extracció, el sobrenedant es pot incubar en un bany d'aigua de 37 ~ 42 ℃ durant 5-10 minuts i el següent pas es pot dur a terme després del sobrenedant.es torna tèrbol.
7. Centrifugueu el sobrenedant a unes 11.000 rpm (12.000 × g) durant 10 min a temperatura ambient (la temperatura ha de ser >25 ℃) per separar la fase.La fase aquosa superior conté l'ADN, mentre que la capa inferior de fase oleosa blava conté endotoxina i altres impureses.Transfereix elFase aquosa que conté ADN a un tub nou idescartar la capa greixosa.
Δ La temperatura durant la centrifugació ha de ser superior a 25 ℃, ja que la separació de fases efectiva no ho faes produeix si la temperatura és massa baixa.
Δ Si la separació de fases no és efectiva, la temperatura de centrifugació es pot ajustar a 30 ℃ iel temps de centrifugació es pot augmentar a 15 min.
Δ No xucleu la capa greixosa blava, ja que conté endotoxina i altres impureses.
Mecanisme
Resuspensió Lisi Neutralització
◇ Afegiu 7,5 ml de tampó P1
◇ Afegiu 7,5 ml de tampó P2
◇ Afegiu 7,5 ml de tampó P4
Eliminació d'endotoxines
◇Afegiu 0,1 vegades el volum del sobrenedant d'Endotoxin Scavenger
Enquadernació i rentat
◇ Afegiu 0,5 vegades el volum d'isopropanol
◇ Afegiu 10 ml de tampó PW
◇ Afegiu 10 ml de tampó PW
Elució
◇ Afegiu 1 – 2 ml de tampó TB o ddH2O lliure d'endotoxines
