Kit de PCR directe de plantes
Cat No: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit és adequat per a l'amplificació directa de fulles de plantes, llavors, etc., i es pot utilitzar per al cribratge d'alt rendiment de mostres de plantes que no contenen polisacàrids i polifenols.L'ADN polimerasa d'amplificació directa basada en l'evolució dirigida té una tolerància superior als inhibidors de la PCR en plantes.Mentrestant, manté l'alt rendiment d'amplificació, que és adequat per a l'amplificació de fragments d'ADN dins de 5 kb.L'únic tampó de lisi A del kit es pot utilitzar per lisar teixits vegetals frescos o congelats.És fàcil d'operar i el lisat es pot utilitzar com a plantilla per a l'amplificació sense purificació.El sistema conté agents protectors que permeten que les mostres brutes s'amplifiquin de manera eficaç després de congelacions i descongelacions repetides.2 × Plant Direct Master Mix només necessita afegir primers i plantilles per dur a terme la reacció d'amplificació, reduint així les operacions de pipeteig i millorant el rendiment de detecció i la reproductibilitat dels resultats.
Components
| Components | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Tampó de lisi directa de plantes A | 5 ml | 20 ml |
| Tampó de lisi directa de plantes B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B és un reactiu opcional, que s'utilitza per neutralitzar Plant Direct Lysis Buffer A per allargar el temps d'emmagatzematge de les mostres.Es pot utilitzar segons la situació real.
Condicions d'emmagatzematge
2 × Plant Direct Master Mix, emmagatzemar a -30 ~ -15 ℃ i evitar la congelació i descongelació repetida;Tampó de lisi directa de plantes, emmagatzemar a -30 ~ -15 ℃ o 2 ~ 8 ℃.
Procés d'experimentació
Processament de mostres–Fulla de planta
Mètode directe:Es recomana utilitzar fulles joves.Utilitzeu una perforadora amb un diàmetre fix de 0,5 a 3 mm per obtenir una mostra petita i uniforme, i després afegiu-la directament al sistema de PCR (es recomana un sistema de 50 μl).Tingueu en compte que assegureu-vos que la mostra estigui a la solució de PCR i no a la paret del tub.Si s'utilitza PCR directa per amplificar fragments llargs i mostres complexes, utilitzar una mostra amb un diàmetre més petit (0,5 – 1 mm) com a plantilla pot ajudar a obtenir millors resultats.
Mètode de lisi de mòlta:Es recomana utilitzar fulles joves.Agafeu un tros petit de fulla (d'uns 1 – 3 mm de diàmetre), col·loqueu-lo en 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab i tritureu-lo tant com sigui possible (aquest pas es pot fer prement la fulla amb una punta de pipeta de 100 μl). per triturar la mostra).Si s'utilitzen volums més grans de teixit de fulla (no superen els 7 mm), augmenteu el volum de tampó de dilució a 50 μl.Després que les fulles estiguin mòltes, la solució hauria de semblar verda.Després d'una breu centrifugació, afegiu 1 μl del sobrenedant al sistema de PCR com a plantilla de reaccióc.
Mètode de lisi tèrmica:Es recomana utilitzar fulles joves.Agafeu un tros petit de fulla (d'uns 1-3 mm de diàmetre), col·loqueu-lo en 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A i escalfeu-lo a 95 °C durant 5-10 min.El temps de lisi es pot allargar adequadament per a fulles difícils de lisar (no més de 20 min).Si s'utilitzen volums més grans de teixit de fulla (no superen els 7 mm), augmenteu el volum de tampó de dilució a 50 μl.Després de l'escalfament, centrifugueu breument i afegiu 1 μl de sobrenedant al sistema de PCR com a plantilla de reacciób.
Processament de mostres-Plant Llavor
Mètode de lisi de mòlta:Utilitzeu un bisturí per tallar llavors amb un diàmetre de 5 mm, afegir-les a 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A i triturar la mostra amb una punta de pipeta o altres eines.Agitar breument i deixar reposar a temperatura ambient durant 3-5 minuts.Assegureu-vos que la mostra de llavors estigui submergida al tampó de dilució.Després d'una breu centrifugació, afegiu 1 μl del sobrenedant al sistema de PCR com a plantilla de reacció.
Mètode de lisi tèrmica:Utilitzeu un bisturí per tallar llavors amb un diàmetre de 5 mm, afegiu-les a 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A i escalfeu-les a 95 °C durant 5-10 min.El temps de lisi es pot allargar adequadament per a fulles difícils de lisar (no més de 30 min).Després de l'escalfament, centrifugueu breument i afegiu 1 μl de sobrenedant al sistema de PCR com a plantilla de reacciób.
a.També es poden utilitzar tisores o altres eines per tallar mostres de mida adequada;si el punxó o les tisores es reutilitzen, s'han de netejar amb una solució d'hipoclorit de sodi al 2% abans de cada ús per evitar la contaminació creuada entre mostres.
b.Assegureu-vos que el tampó de lisi directa de la planta estigui completament fos abans d'utilitzar-lo.Si el tampó és viscós o té precipitats, es pot escalfar a 37 ℃ per fondre'l completament abans d'utilitzar-lo.
c.El volum de plantilla del sistema de reacció es pot ajustar adequadament segons la diferència de volum de material vegetal i diluent afegit.
Tampó de lisi directa de plantes
El tampó A de lisi directa de plantes contingut en aquest producte s'ha optimitzat estrictament per alliberar el genoma de la majoria de teixits vegetals i és adequat per a l'emmagatzematge a curt termini de plantes brutes a 4 ℃.Si la mostra s'ha d'emmagatzemar durant un període de temps més llarg (per exemple, 1-2 mesos), es recomana transferir el sobrenedant a un tub EP nou i emmagatzemar-lo a -20 ℃.Per emmagatzemar les mostres de manera més estable, afegiu un volum igual de tampó de lisi directa de plantes B al sobrenedant transferit, barregeu bé i emmagatzemeu-lo a -20 ℃.El temps d'emmagatzematge estable varia segons les mostres i els estats de la planta.
Sistema de reacció
| ddH2O | Fins a 20,0 µl | Fins a 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Mostra de fulla de planta/extracte brut(Consulteu Processament de mostres) | Disc de fulla de 0,5 – 3 mm/x µl | Disc de fulla de 0,5 – 3 mm/x µl |
a.Conté Mg2+a una concentració final de 2 mM.
b.Es recomana utilitzar una concentració final de 0,4 μM per a cada imprimació.L'ús excessiu d'encebadors augmentarà l'amplificació inespecífica.
c.La quantitat de mostra utilitzada es pot ajustar segons la situació real.La quantitat utilitzada en una única reacció de mostra lisa bruta es pot ajustar entre el 2% i el 20% del volum total de la reacció.L'ús de massa mostres pot provocar un error d'amplificació.
Programa de reacció
| Passos | Temperatura | Temps |
| Desnaturalització inicial | 98℃ | 5 min |
| Desnaturalització | 95℃ | 10 segons |
| Recuit | 58 ~ 72 ℃ | 15 segons |
| Extensió | 72℃ | 30 segons |
| Pròrroga final | 72℃ | 5 min |
a.La desnaturalització inicial (98 ℃, 5 min) afavoreix la lisi del teixit vegetal, alliberant ADN genòmic que es pot utilitzar per a l'amplificació per PCR.No reduïu el temps ni reduïu la temperatura.
b.Es recomana ajustar-lo igual al valor de Tm de l'imprimació o 2 ~ 4 ℃ superior al valor de Tm.L'ADN polimerasa d'amplificació directa utilitzada en aquest producte és diferent de la convencional Taq DNA polimerasa i té requisits especials per a la temperatura de recuit de la reacció; l'ús d'alta temperatura de recuit pot reduir eficaçment l'amplificació inespecífica i millorar l'eficiència de l'amplificació.Per a plantilles complexes, l'amplificació eficient es pot aconseguir ajustant la temperatura de recuit i allargant el temps d'extensió.
c.Si la durada del producte d'amplificació és ≤1 kb, el temps d'extensió s'estableix en 30 segons/kb;si la durada del producte d'amplificació és > 1 kb, el temps d'extensió es fixa en 60 segons/kb.
d.Per a mostres complexes o amb un baix rendiment d'amplificació, el nombre de cicles es pot augmentar adequadament a 40-50 cicles.
Aplicacions
És aplicable per a l'amplificació directa de teixits vegetals i el cribratge d'alt rendiment de mostres de plantes que no contenen polisacàrids i polifenols.
Notes
Només per a ús d'investigació.No s'utilitza en procediments de diagnòstic.
1. Per a l'amplificació de plantes brutes o l'amplificació directa, es recomana utilitzar ADN genòmic purificat com a control positiu abans d'iniciar l'experiment per assegurar-se que el sistema, els cebadors i les operacions són correctes.
2. L'ADN polimerasa d'amplificació directa utilitzada en aquest kit té una forta activitat de correcció de proves.Si s'ha de realitzar la clonació TA, es recomana purificar l'ADN abans d'afegir l'adenina.
3. Guia de disseny de primers:
a.Es recomana que l'última base a l'extrem 3' de la imprimació sigui G o C.
b.S'han d'evitar els desajustaments consecutius en les 8 últimes bases a l'extrem 3' de la imprimació.c.Eviteu les estructures de forquilla a l'extrem 3' de la imprimació.
d.Les diferències en el valor de Tm de l'imprimació directa i la imprimació inversa no han de ser superiors a 1 ℃ i el valor de Tm s'ha d'ajustar a 60 ~ 72 ℃ (es recomana Primer Premier 5 per calcular el valor de Tm).
e.No s'han d'incloure seqüències d'imprimació addicionals addicionals que no coincideixen amb la plantilla en calcular el valor de Tm de l'encebador.
f.Es recomana que el contingut de GC de la imprimació sigui del 40% al 60%.
g.La distribució global d'A, G, C i T a l'imprimació hauria de ser el més uniforme possible.Eviteu utilitzar regions amb alts continguts de GC o AT.
h.Eviteu la presència de seqüències complementàries de 5 o més bases ja sigui dins del cebador o entre dos cebadors i eviteu la presència de seqüències complementàries de 3 o més bases a l'extrem 3′ de dos cebadors.
i.Utilitzeu la funció NCBI BLAST per comprovar l'especificitat de l'encebador per evitar l'amplificació inespecífica.
