Inhibidor de rnasa
L'inhibidor de la RNasa murina és un inhibidor de la RNasa murina recombinant expressat i purificat a partir d'E.coli.S'uneix a la RNasa A, B o C en una proporció 1:1 mitjançant enllaços no covalents, inhibint així l'activitat dels tres enzims i protegint l'ARN de la degradació.Tanmateix, no és efectiu contra la RNasa 1, la RNasa T1, la nucleasa S1, la RNasa H o la RNasa d'Aspergillus.L'inhibidor de la RNasa murina es va provar mitjançant RT-PCR, RT-qPCR i ARNm IVT i era compatible amb diverses transcriptases inverses, ADN polimerases i ARN polimerases comercials.
En comparació amb els inhibidors de la RNasa humana, l'inhibidor de la RNasa murina no conté dues cisteïnes altament sensibles a l'oxidació que provoca la inactivació de l'inhibidor.Això fa que sigui estable a baixes concentracions de TDT (menys d'1 mM).Aquesta característica el fa adequat per utilitzar-lo en reaccions on altes concentracions de DTT són adverses per a la reacció (p. ex. RT-PCR en temps real).
Aaplicació
Aquest producte es pot utilitzar àmpliament en qualsevol experiment on la interferència de la RNasa sigui possible per evitar la degradació de l'ARN, com ara:
1.Síntesi de la primera cadena d'ADNc, RT-PCR, RT-qPCR, etc.
2.Protegeix l'ARN de la degradació durant la transcripció/traducció in vitro (per exemple, el sistema de replicació viral in vitro).
3.Inhibició de l'activitat de la RNasa durant la separació i purificació de l'ARN.
Condicions d'emmagatzematge
El producte es pot emmagatzemar a -25~- 15 ℃, vàlid durant 2 anys.
Buffer d'emmagatzematge
KCl 50 mM, HEPES-KOH 20 mM (pH 7,6, 25 ℃), DTT 8 mM i glicerol al 50%.
Definició de la unitat
La quantitat d'inhibidor de la RNasa murina necessària per inhibir l'activitat de 5 ng de ribonucleasa A en un 50% es va definir com una unitat (U).
Pes molecular de la proteïna
El pes molecular de l'inhibidor de la RNasa murina és de 50 kDa.
Control de qualitat
Exonucleasa Activitat:
40 U d'inhibidor de la RNasa murina amb 1 μg d'ADN digerit λ -Hind III a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.
Activitat de l'endonucleasa:
40 U d'inhibidor de la RNasa murina amb 1 μ g λ DNA a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.
Nicking Activitat:
40 U d'inhibidor de la RNasa murina amb 1 μ g de pBR322 a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.
RNasa Activitat:
40 U d'inhibidor de RNasa murina amb 1, 6 μ g d'ARN MS2 durant 4 h a 37 ℃ no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.
E.ADN coli:
40 U d'inhibidor de la RNasa murina s'examinen per detectar la presència d'ADN genòmic d'E. coli mitjançant qPCR TaqMan amb cebadors específics per al locus de l'ARNr 16S d'E. coli.La contaminació de l'ADN genòmic d'E. coli és ≤ 0,1 pg/40 U.
Notes
1. L'oscil·lació o l'agitació violentes provocaran la inactivació de l'enzim.
2. El rang de temperatura òptim d'aquest inhibidor era de 25-55 ℃ i es va inactivar a 65 ℃ i més.
3.Les activitats de la RNasa H, la RNasa 1 i la RNasa T1 no van ser inhibides per l'inhibidor de la RNasa murina.
4. La inhibició de l'activitat de la RNasa es va trobar en un ampli rang de pH (pH 5-9 eren tots actius), i l'activitat més alta es va observar a pH 7-8.
5. Atès que les ribonucleases solen conservar l'activitat en condicions de desnaturalització, s'ha de tenir cura d'evitar la desnaturalització de les molècules inhibidores de la RNasa que s'han complexat amb una ribonucleasa.Per evitar l'alliberament de ribonucleasa activa, s'han d'evitar temperatures superiors a 50 °C i altes concentracions d'urea o altres agents desnaturalitzants.
