Mini kit d'extracció d'ADN
Aquest kit adopta un sistema de tampó optimitzat i una tecnologia de purificació de columna de gel de sílice, que pot recuperar fragments d'ADN de 70 pb - 20 kb de diverses concentracions de gel d'agarosa TAE o TBE.La columna d'adsorció d'ADN pot adsorbir especialment l'ADN en condicions d'alta sal.A més, el kit pot purificar directament fragments d'ADN de productes de PCR, sistemes de reacció enzimàtica o productes d'ADN brut obtinguts per altres mètodes, i eliminar impureses com proteïnes, altres compostos orgànics, ions de sal inorgànics i cebadors d'oligonucleòtids.Pot assegurar-se que la purificació es pot completar en 10-15 minuts.L'ADN purificat es pot utilitzar directament per a la lligadura, transformació, digestió enzimàtica, transcripció in vitro, PCR, seqüenciació, microinjecció, etc.
Condicions d'emmagatzematge
Emmagatzemar a -15 ~ -25 ℃ i transportar a temperatura ambient.
Components
| Components | (100 rxns) |
| Tampó del PIB | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Tampó d'elució | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
PIB tampon:Tampó d'unió al DNA.
Buffer GW:Tampó de rentat;afegiu etanol absolut pel volum indicat a l'ampolla abans d'utilitzar-lo.
Tampó d'elució:Elució.
FastPure DNA Mini Columns-G:Columnes d'adsorció d'ADN.
Tubs de recollida 2 ml:Tubs de recollida per filtrat.
Materials preparats
Tubs esterilitzats d'1,5 ml, etanol absolut i isopropanol (quan el fragment d'ADN ≤100 pb, afegiu 1 volum
isopropanol a 1 volum de gel), bany maria.
Procés d'experimentació
Afegiu 80 ml d'etanol per diluir Buffer GW tal com s'indica a l'etiqueta abans d'utilitzar-lo, emmagatzemar a temperatura ambient.
Mecanisme
1. Solució de reacció PCR
Esquema d'extracció de gel: afegiu el mateix volum de tampó GDP esquema de recuperació de la solució de reacció de PCR:Afegiu 5 vegades el volum buffer
2. PIB Calcula el volum de gel (100 μl equival a 100 mg)
Dissoldre el gel
3. Preescalfeu a 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Afegiu 300 μL de buffer GDP*
Afegiu 700 μL de Buffer GW
Afegiu 700 μL de Buffer GW
5. Eluir
Afegiu 20 – 30 μL de tampó d'elució o aigua desionitzada
Notes* Recuperació del fluid de reacció PCR sense aquest pas
Programa d'extracció de gel
1. Després de l'electroforesi de l'ADN per fraccionar fragments d'ADN, escindi la franja única del fragment d'ADN del gel d'agarosa sota llum UV.Es recomana utilitzar paper absorbent per absorbir la humitat aparent del gel i minimitzar la mida de la rodanxa de gel eliminant l'agarosa addicional com sigui possible.Peseu el tros de gel (sense tub de microcentrífuga) per calcular-ne el volum: el volum de 100 mg de trossos de gel és d'aproximadament 100 μL, suposant que la densitat és d'1 g/ml.
2. Afegiu el mateix volum Buffer GDP, incubeu a 50 ~ 55 ℃ durant 7-10 min (segons la mida del gel, ajusteu el temps d'incubació fins que el gel es dissolgui completament).Inverteix el tub 2 vegades durant la incubació.
Δ L'addició d'1-3 volums de Buffer GDP no influirà en l'eficiència de recuperació de l'ADN.Si el fragment d'ADN que s'ha de recuperar <100 pb, s'han d'afegir 3 volums de Buffer GDP;quan la rodanxa de gel s'hagi dissolt completament, afegiu 1 volum d'isopropanol i barregeu-ho bé i, a continuació, continueu amb el següent pas.
3. Centrifugueu breument per portar la mostra al fons del tub, introduïu les FastPure DNA Mini Columns-G als tubs de recollida de 2 ml, transferiu amb cura la solució com a màxim de 700 μL una vegada al
temps fins a les columnes de filtració, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durant 30-60 segons.
4. Descartar el filtrat i afegir 300 μL de Buffer GDP a la columna, incubar a temperatura ambient durant 1 min, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durant 30-60 segons.
5. Descartar el filtrat i afegir 700 μL de Buffer GW (comprovar si s'ha afegit etanol absolut per endavant!) a la columna, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durant 30-60 segons.
Δ Si us plau, afegiu Buffer GW al voltant de la paret de la columna d'adsorció o afegiu la coberta posterior de Buffer GW i barregeu-lo cap per avall durant 2 o 3 vegades per ajudar a netejar completament la sal que s'adhereix a la paret del tub.
6. Repetiu el pas 5.
Δ El rentat amb buffer GW dues vegades pot garantir que la sal s'elimini completament i eliminar l'impacte en experiments posteriors.
7. Descartar el filtrat i centrifugar la columna buida a 12.000 rpm (13.800 X g) durant 2 min.
8. Introduïu la columna en un tub de microcentrífuga net d'1,5 ml, afegiu 20 - 30 μL de tampó d'elució al centre de la membrana de la columna, incubeu durant 2 min i, a continuació, centrifugueu a 12.000 rpm (13.800 X g) durant 1 min.Descartar la columna, emmagatzemar l'ADN obtingut a -20 .
Δ Transferir el sobrenedant del pas 8 a la columna per tornar a eluir i preescalfar el tampó d'elució a 55 (quan el fragment d'ADN > 3 kb) pot ser útil per augmentar l'eficiència de recuperació.
Programa de recuperació de productes de PCR
Aquest protocol és aplicable per purificar fragments d'ADN de productes de PCR, sistema de reacció enzimàtica i altres productes bruts d'ADN (inclòs l'ADN genètic).Aquesta solució pot eliminar de manera eficient diversos nucleòtids, cebadors, dímers d'imprimació, molècules de sal, enzims i altres impureses.
1. Centrifuga breument els productes de PCR, la solució de reacció enzimàtica i altres productes bruts d'ADN.Estimar el seu volum amb una pipeta i transferir-lo a un tub esterilitzat d'1,5 ml o 2 ml.Afegiu ddH2O fins que el volum fins a 100 μL;mentre que per a l'ADN genòmic amb alta concentració, diluir a 300 μL amb ddH2O ajudarà a millorar l'eficiència de recuperació.
2. Afegiu 5 volums de Buffer GDP, barregeu-los bé invertint o agitant-lo amb vòrtex.Si el fragment d'ADN d'interès > 100 pb, cal afegir 1,5 volums addicionals (mostres + GDP tampó) d'etanol.
3. Torneu a inserir la columna al tub de recollida, transferiu la barreja a la columna, centrifugueu a 12.000 rpm (13.800 ×g) durant 30 – 60 segons.Si el volum de la solució barrejada és > 700 µL, torneu a posar la columna d'adsorció al tub de recollida, transferiu la solució restant a la columna d'adsorció i centrifugueu a 12.000 rpm (13.800 × g) durant 30-60 segons.
4. La següent actuació fa referència al pas 5 – 8 del programa d'extracció 08-1/Gel.
Aplicacions
Diverses concentracions de gel d'agarosa TAE o TBE;Productes de PCR, sistemes de reacció enzimàtica o altres productes d'ADN brut obtinguts per diversos mètodes.Els fragments recuperats van anar de70 pb -20 kb.
Notes
Només per a ús d'investigació.No s'utilitza en procediments de diagnòstic.
1. Afegiu 80 ml d'etanol per diluir Buffer GW tal com s'indica a l'etiqueta abans d'utilitzar-lo, emmagatzemeu-lo a temperatura ambient.
2. Si el buffer GDP és fàcil de precipitar durant l'emmagatzematge a baixa temperatura, es pot col·locar a temperatura ambient durant un període de temps abans d'utilitzar-lo.Si cal, es pot preescalfar en un bany d'aigua a 37 ℃ fins que el precipitat es dissolgui completament, i després es pot utilitzar després de la barreja.
3. Establiu la temperatura del bany d'aigua a 50 ~ 55 ℃ per endavant.
4. Al pas 1 del programa d'extracció 08-1/Gel, la minimització de la mida de la rodanxa de gel reduirà significativament el temps de dissolució i augmentarà l'eficiència de recuperació (l'ADN linealitzat s'hidrolitza fàcilment quan s'exposa contínuament a alta temperatura).No exposeu el gel d'ADN als UV durant molt de temps, ja que la llum ultraviolada pot causar danys a l'ADN.
5. Dissoleu completament el gel al pas 2 del programa d'extracció 08- 1/Gel, en cas contrari, l'eficiència de recuperació de l'ADN es veurà greument afectada.
6. Preescalfeu el tampó d'elució o ddH2O a 55 ℃, que és útil per millorar l'eficiència d'elució de l'ADN.Es recomana emmagatzemar l'ADN en un eluent de 2,5 mM de Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
