2 × Sensi Direct Premix-UNG (sonda qPCR)
Cat No: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) està dissenyat per realitzar PCR directament a partir de mostres sense extracció d'ADN ni preparació de mostres.Aquest reactiu consisteix en ADN polimerasa d'inici en calent, ADN glicosilasa d'uracil (UNG), inhibidor de RNasa, MgCl2, dNTPs (amb dUTP en lloc de dTTP) i estabilitzadors, per a PCR quantitativa (qPCR).Aquest reactiu preforma una alta tolerància als inhibidors i, per tant, es pot aplicar directament a la detecció de mostres com hisop de gola, saliva, sang sencera anticoagulada, plasma i sèrum sense extracció d'ADN.El reactiu utilitza un tampó patentat per a qPCR amb enzims mixts d'ADN polimerasa antiinhibidor i enzim UNG.Per tant, pot obtenir una bona amplificació dels gens diana en mostres que contenen inhibidors i inhibir l'amplificació falsa positiva causada per la contaminació residual de PCR i aerosol.Aquest reactiu és compatible amb la majoria dels instruments de PCR quantitatius fluorescents, com ara Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche, etc.
Components
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2 × tampó de premescla SensiDirect (dUTP)
Condicions d'emmagatzematge
Tots els components s'han de mantenir a -20 ℃ per a l'emmagatzematge a llarg termini i 4 ℃ fins a 3 mesos.Si us plau, barrejar bé després de descongelar i centrifugar abans d'utilitzar.Eviteu la congelació-descongelació freqüent.
Protocol de ciclisme
| Pas | Temperatura | Temps | Cicle |
| Digestió | 50℃ | 2 min | 1 |
| Activació de la polimerasa | 95℃ | 1-5 min | 1 |
| Desnaturalitzar | 95℃ | 10-20 anys | 40-50 |
| Recuit/Extensió | 56-64 ℃ | Anys 20-60 |
Instruccions de pipeteig
| Reactiu | Volum per reacció | Volum per reacció | Concentració final |
| 2 × tampó de premescla SensiDirect (dUTP) | 12,5 µl | 25 µl | 1× |
| 50 × SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 25 × mescla imprimació-sonda1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Mostra3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volum total | 25 μl | 50 μl | - |
1. La concentració final d'imprimació sol ser de 0,2μM.Per obtenir millors resultats, la concentració d'imprimació es pot optimitzar dins del rang de 0,2-1μM.
2. En general, la concentració de la sonda es pot optimitzar dins del rang de 0,1-0,3μM.La concentració òptima de la sonda està relacionada amb l'instrument d'amplificació de PCR en temps real, el tipus de sonda i el tipus de substància d'etiquetatge fluorescent.Consulteu el manual de l'instrument o els requisits específics de cada sonda fluorescent.
3. Els diferents tipus de mostres contenen diferents tipus i contingut d'inhibidor i nombre de còpies del gen objectiu.El volum de la mostra s'ha de considerar segons les condicions reals.Feu una dilució de la mostra afegint aigua sense nucleases o tampó TE, si cal.
4. Volum recomanat de diferents mostres:
| Mostra | Volum per a un 50 μL reacció | Màxim proporció |
| Sang sencera anticoagulada | 2,5 μl | 5% |
| Plasma | 15 μl | 30% |
| Sèrum | 10 μl | 20% |
| Hisop de gola | 10 μl | 20% |
| Saliva | 10 μl | 20% |
Control de qualitat
1. Detecció de funcions: sensibilitat, especificitat i repetibilitat de la qPCR.
2. No hi ha activitat nucleasa exògena: no hi ha contaminació d'endonucleases i exonucleases exògenes.
Notes de producte
1. Aquest producte empra un nou tipus d'ADN polimerasa d'inici en calent, que es pot activar en 1-5 minuts. Atès que el seu tampó de reacció s'ha optimitzat, és més adequat per a PCR quantitativa de fluorescència doble o múltiple mitjançant el mètode de la sonda.
2. Si el valor Rn de l'amplificació de la PCR és massa baix o l'amplificació està òbviament inhibida, disminuir la quantitat de mostra, augmentar el volum de reacció o la dilució prèvia de la mostra pot millorar els resultats.
3. La recollida de sang, saliva, orina, hisop de gola, etc. ha de seguir els requisits dels criteris clínics, i es pot utilitzar una mostra fresca per evitar la degradació de l'àcid nucleic.
4. Atès que els diferents amplicons tenen una eficiència d'utilització diferent a dUTP i sensibilitat a UNG, els reactius s'han d'optimitzar si la sensibilitat de detecció disminueix quan s'utilitza el sistema UNG.Si us plau, poseu-vos en contacte amb nosaltres per obtenir suport tècnic si cal.
5. Per evitar l'amplificació dels productes de PCR de transferència entre reaccions d'un sol pas, es requereix una àrea experimental dedicada i una pipeta per a l'amplificació.Funcioneu amb guants i canvieu-los amb freqüència i no obriu el tub de reacció després de l'amplificació per PCR.
