ADN glicosilasa d'uracil
L'uracil-ADN glicosilasa (UNG o UDG) és un clon recombinant d'E.coli amb un pes molecular de 25 kDa.Catalitza l'alliberament d'uracil lliure de l'ADN monocatenari i doble que conté uracil, és inactiu contra l'ARN i es pot utilitzar per prevenir la contaminació dels productes d'amplificació per PCR.El principi d'acció es basa en el fet que si se substitueix dUTP per dTTP en la reacció de PCR i es forma un producte d'amplificació de PCR que conté bases dU, l'enzim pot trencar selectivament l'enllaç glicosídic de les bases U en una cadena simple i doble cadena. ADN i degradar el producte d'amplificació per PCR.
Aplicació recomanada
Prevenció de la contaminació Amplificació
Condició d'emmagatzematge
-20 °C per a l'emmagatzematge a llarg termini, s'ha de barrejar bé abans d'utilitzar, evitar la congelació-descongelació freqüent.
Buffer d'emmagatzematge
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, estabilitzador, glicerol al 50%.
Definició de la unitat
La quantitat d'enzim necessària per degradar 1 µg d'ADN monocatenari que conté bases dU en 1 hora a 37 °C és 1 unitat.
Control de qualitat
1.Puresa electroforètica SDS-PAGE superior al 98%
2.Sensibilitat d'amplificació, control de lot a lot, estabilitat
3.Després de tractar 1U d'UNG a 50 ℃ durant 2 minuts, la plantilla que contingui U per sota de 103 còpies s'hauria de degradar completament i no es pot produir cap producte d'amplificació.
4.No hi ha activitat nucleasa exògena
Instruccions
| Components | Volum (μl) | Concentració final |
| 10 × tampó PCR (sense dNTP, Mg²+gratuït) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (substitueix dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM de MgCl2 | 2-8 μl | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Plantilla | - | <1 μg/reacció |
| ddH₂O | Fins als 50 | - |
Nota: a: Si s'utilitza per a qPCR/qRT-PCR, la sonda fluorescent s'ha d'afegir al sistema de reacció.Normalment, una concentració final d'imprimació de 0,2 μM pot donar bons resultats;quan el rendiment de la reacció és baix, la concentració d'imprimació es pot ajustar en el rang de 0,2-1 μM.Normalment, la concentració de la sonda s'optimitza en el rang de 0,1-0,3 μM.Es poden realitzar experiments de gradient de concentració per trobar la millor combinació d'imprimació i sonda.
Notes
1.L'enzim UNG es pot utilitzar per eliminar els productes d'amplificació dUTP contaminats del sistema de reacció abans de la reacció d'amplificació de PCR i, a continuació, evitar resultats falsos positius a causa de la contaminació del producte.
2.La temperatura òptima perquè l'enzim UNG s'utilitzi en la reacció PCR anticontaminació és generalment de 50 ℃ durant 2 minuts;la condició d'inactivació és de 95 ℃ durant 5 minuts.
3.Eviteu la congelació-descongelació freqüent i no exposeu a grans fluctuacions de temperatura.
4.Els diferents gens que s'han d'amplificar tenen una eficiència d'utilització diferent de dUTP i sensibilitat a l'enzim UNG, per tant, si l'ús del sistema UNG condueix a una disminució de la sensibilitat de detecció, el sistema de reacció s'ha d'ajustar i optimitzar, si necessiteu suport tècnic, poseu-vos en contacte amb la nostra companyia.
