ADN polimerasa Wild Taq
La Taq DNA Polymerase és una DNA polimerasa termoestable de Thermus aquaticus YT-1, que posseeix una activitat polimerasa 5′→3′ i una activitat endonucleasa flap de 5′.
Components
| Component | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10 × Taq Buffer | 2 × 1 ml | 2 × 10 ml | 2 × 50 ml | 5 × 200 ml |
| Taq DNA polimerasa (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5 × 10 ml |
Condició d'emmagatzematge
Transport a menys de 0 °C i emmagatzemat a -25 °C ~ -15 °C.
Definició de la unitat
Una unitat es defineix com la quantitat d'enzim que incorpora 15 nmol de dNTP al material insoluble en àcid en 30 minuts a 75 °C.
Control de qualitat
1.Assaig de puresa de proteïnes (SDS-PAGE):La puresa de l'ADN polimerasa Taq es va determinar ≥95% mitjançant l'anàlisi SDS-PAGE.
2.EndActivitat onucleasa:Un mínim de 5 U d'ADN polimerasa Taq amb 1 μg d'ADN λ durant 16 hores a 37 ℃ no produeix una degradació detectable tal com es determina.
3.Activitat exonucleasa:Un mínim de 5 U d'ADN polimerasa Taq amb 1 μg d'ADN de digestió λ -Hind Ⅲ durant 16 hores a 37 ℃ no produeix una degradació detectable tal com es determina.
4.Activitat Nickase:Un mínim de 5 U d'ADN polimerasa Taq amb 1 μg d'ADN pBR322 durant 16 hores a 37 °C no produeix una degradació detectable tal com es determina.
5.Activitat RNasa:Un mínim de 5 U d'ADN polimerasa Taq amb 1,6 μg d'ARN MS2 durant 16 hores a 37 °C no produeix una degradació detectable tal com es determina.
6.E. coliADN:5 U d'ADN polimerasa Taq s'examinen per detectar la presència d'ADN genòmic d'E. coli utilitzant TaqMan qPCR amb cebadors específics per al locus de l'ARNr 16S d'E. coli.La contaminació de l'ADN genòmic d'E. coli és ≤1 còpia.
7.Amplificació per PCR (ADN Lambda de 5,0 kb)- Una reacció de 50 µL que conté 5 ng d'ADN Lambda amb 5 unitats d'ADN polimerasa Taq durant 25 cicles d'amplificació per PCR dóna com a resultat el producte esperat de 5,0 kb.
Configuració de la reacció
| Components | Volum |
| Plantilla d'ADNa | opcional |
| Primer 10 μM directe | 1 μl |
| Primer 10 μM invers | 1 μl |
| Barreja dNTP (10 mM cadascun) | 1 μl |
| 10 × Taq Buffer | 5 μl |
| Taq DNA polimerasab | 0,25 μl |
| Aigua lliure de nucleases | Fins a 50 μL |
Notes:
1) La concentració òptima de reacció de diferents plantilles és diferent.La taula següent mostra l'ús de plantilla recomanat del sistema de reacció de 50 µL.
| ADN | Import |
| Genòmica | 1 ng-1 μg |
| Viral o plasmidi | 1 pàg-1 ng |
2) La concentració òptima de Taq DNA polimerasa pot oscil·lar entre 0,25 µL ~ 1 µL en aplicacions especialitzades.
ReaccióPrograma
| Pas | Temperatura(°C) | Temps | Cicles |
| Desnaturalització iniciala | 95 ℃ | 5 minuts | - |
| Desnaturalització | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Cicles |
| Recuitb | 60 ℃ | 15 s | |
| Extensió | 72 ℃ | 1 kb/min | |
| Pròrroga final | 72 ℃ | 5 minuts | - |
Notes:
1) La condició de desnaturalització inicial és adequada per a la majoria de reaccions d'amplificació i es pot modificar segons la complexitat de l'estructura de la plantilla.Si l'estructura de la plantilla és complexa, el temps de pre-desnaturalització es pot ampliar a 5-10 minuts per millorar l'efecte de desnaturalització inicial.
2) La temperatura de recuit s'ha d'ajustar segons el valor Tm de l'imprimació, que generalment s'estableix entre 3 i 5 ℃ per sota del valor Tm de l'imprimació;Per a plantilles complexes, és necessari ajustar la temperatura de recuit i allargar el temps d'extensió per aconseguir una amplificació eficient.
