RTL transcriptasa inversa
La transcriptasa inversa RTL és una ADN polimerasa depenent de la plantilla d'ARN que no té l'activitat exonucleasa 3'→5' i té activitat RNasa H.Aquest enzim pot utilitzar l'ARN com a plantilla per sintetitzar una cadena complementària d'ADN, que es pot aplicar a la síntesi d'ADNc de la primera cadena, especialment per a RT-LAMP (amplificació isotèrmica mediada per bucle).En comparació amb la transcriptasa inversa RTL 1.0, la sensibilitat millora significativament, l'estabilitat tèrmica és més forta i la reacció a 65 ° C és més estable.La transcriptasa inversa RTL (sense glicerol) es pot utilitzar per preparar preparats liofilitzats, reactius RT-LAMP liofilitzats, etc.
Definició de la unitat
Una unitat incorpora 1 nmol de dTTP en material precipitable amb àcid en 20 minuts a 50 °C utilitzant poli(A)•oligo(dT)25 com a imprimació de plantilla.
Components
| Component | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL transcriptasa inversa (sense glicerol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Condició d'emmagatzematge
Transport a menys de 0 °C i emmagatzemat a -25 °C ~ -15 °C.
Control de qualitat
- Activitat Residual deEndonucleasa:Una reacció de 50 μL que conté 1 μg d'ADN λ i 15 unitats de RTL2.0 incubades durant 16 hores a 37 ℃ mostra el mateix patró que el control negatiu mitjançant electroforesi en gel.
- Activitat Residual deExonucleasa:Una reacció de 50 μL que conté 1 μg d'ADN λ digerit Hind Ⅲ i 15 unitats de RTL2.0 incubades durant 16 hores a 37 ℃ mostra el mateix patró que el control negatiu per electroforesi en gel.
- Activitat Residual deNickase:Una reacció de 50 μL que conté 1 μg de pBR322 superenrotllat i 15 unitats de RTL2.0 incubades durant 4 hores a 37 ° C mostra el mateix patró que el control negatiu mitjançant electroforesi en gel.
- Activitat Residual deRNasa:Una reacció de 10 μL que conté 0,48 μg d'ARN MS2 i 15 unitats de RTL2.0 incubades durant 4 hores a 37 ° C mostra el mateix patró que el control negatiu mitjançant electroforesi en gel.
- E. coli gADN:Mesurat ambE.colikits de detecció de HCD específics, 15 unitats de RTL2.0 contenen menys d'1E. coligenoma.
Configuració de la reacció
Protocol de síntesi d'ADNc
| Components | Volum |
| Plantilla RNA a | opcional |
| Oligo (dT) 18~25 (50uM) o barreja aleatòria d'imprimació (60uM) | 2 μl |
| Barreja dNTP (10 mM cadascun) | 1 μl |
| Inhibidor de RNasa (40U/uL) | 0,5 μl |
| Transcriptasa inversa RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 μl |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μl |
| Aigua lliure de nucleases | Fins a 20 μL |
Notes:
1) La dosi recomanada d'ARN total és d'1ng ~ 1μg
2) La dosi recomanada d'ARNm era de 50 ng ~ 100 ng
Termo-ciclisme Condicions per a una rutina reacció:
| Temperatura (°C) | Temps |
| 25 °Ca | 5 minuts |
| 55 °C | 10 minutsb |
| 80 °C | 10 minuts |
Notes:
1) Si s'utilitza Random Primer Mix, un pas d'incubació a 25 °C.
2) Si s'utilitza la barreja d'imprimació objectiu, un pas d'incubació a 55 ° C durant 10 ~ 30 minuts.
Protocol RT-LAMP
| Components | Volum | Concentració final |
| Plantilla RNA | opcional | ≥10 còpies |
| Barreja dNTP (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| Primers FIP/BIP (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| Primers F3/B3 (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| Primers LoopF/LoopB (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| Inhibidor de la RNasa (40U/μL) | 0,5 μl | 20 U/Reacció |
| Transcriptasa inversa RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 μl | 7,5 U/Reacció |
| ADN polimerasa Bst V2 (8U/μL) | 1 μl | 8 U/Reacció |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (8 mM total) |
| 10 × HC RTL Buffer (o 10 × HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Aigua lliure de nucleases | Fins a 25 μL | - |
Notes:
1) Barrejar mitjançant vòrtex i centrifugar breument per recollir.Incubació a temperatura constant a 65 °C durant 1 hora.
2) Els dos buffers són interoperables i tenen la mateixa composició.
Notes
1. Aquest producte formarà un sòlid blanc quan s'emmagatzema a -20 °C.Traieu-lo de -20°C i poseu-lo sobre gel durant uns 10 minuts.Després de fondre, es pot utilitzar agitant i barrejant.
2.El producte d'ADNc es pot emmagatzemar a -20 °C o -80 °C o utilitzar-lo immediatament per a la reacció de PCR.
3.Per evitar la contaminació de la RNasa, si us plau, mantingueu neta l'àrea experimental i utilitzeu guants i màscares nets durant el funcionament.
