Transcriptasa inversa M-MLV
RevScript La transcriptasa inversa s'obté mitjançant tecnologia d'enginyeria genètica.Té una major capacitat de síntesi d'ADNc, estabilitat tèrmica i límit de temperatura de reacció (fins a 60 °C).El producte d'ADNc sintetitzat és de fins a 10 kb.Millora l'afinitat de les plantilles i és adequat per a la transcripció inversa de plantilles d'ARN amb estructura secundària complexa o gens de còpia baixa.
Components
| Component | HC2003B (10.000 U) | HC2003B (5 * 10.000 U) | HC2003B (200.000U) |
| Transcriptasa inversa RevScript (200U/μL) | 50 μl | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × Buffer RevScript | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Condició d'emmagatzematge
Aquest producte s'ha d'emmagatzemar a -25 °C ~ -15 °C durant 2 anys.
Definició de la unitat
Una unitat incorpora 1 nmol de dTTP en material insoluble en àcid en 10 minuts a 37 ° C utilitzant Oligo (dT) com a imprimadors.
Configuració de la reacció
1.Desnaturalització de la plantilla d'ARN (Aquest pas és opcional, la desnaturalització de la plantilla d'ARN ajuda a obrir les estructures secundàries, la qual cosa millorarà el rendiment de la primera cadena d'ADNc).
| Components | Volum (μL) |
| ddH lliure de RNasa2O | Fins a les 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) o cebador aleatori (50 μmol/L) O cebadors específics de gens (2 μmol/L) | 1 |
| o 1 | |
| o 1 | |
| Plantilla d'ARN | X a |
Notes:
1) a: ARN total: 1-5 ug o ARNm: 1-500 ng
2) Incubar a 65 °C durant 5 minuts, després transferir-lo a gel immediatament perquè es refredi durant 2 minuts.Una breu centrifugació per recollir el líquid de reacció, afegiu la solució de reacció de transcripció inversa tal com es mostra a la taula següent.Pipeteu suaument per barrejar.
1.Preparació de la mescla de reacció (volum de 20 μL)
| Components | Volum (μL) |
| Barreja del pas anterior | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| Barreja dNTP (10 nmol/L) | 1 |
| Transcriptasa inversa (200 U/μL) | 1 |
| Inhibidor de la RNasa (40 U/μL) | 1 |
1.Realitzeu la reacció en les condicions següents:
| Temperatura (°C) | Temps |
| 25 °Ca | 5 minuts |
| 42 °Cb | 15-30 minuts |
| 85 °Cc | 5 minuts |
Notes:
1) a.La incubació a 25 °C durant 5 minuts només és necessària per utilitzar els hexàmers aleatoris.Si us plau, salteu aquest pas quan feu servir Oligo (dT)18o Gene Specific Primer.
2) b.La temperatura de transcripció inversa recomanada és de 42 °C, per a plantilles amb estructures secundàries complicades o alt contingut de GC, es recomana augmentar la temperatura de reacció a 50-55 °C.
3) c.Escalfament a 85 °C durant 5 minuts per inactivar la transcriptasa inversa.
4) El producte es pot utilitzar directament en reaccions de PCR o qPCR, o emmagatzemar-se a -20 ° C per a un emmagatzematge a curt termini.Es recomana alinear els productes i emmagatzemar-los a -80 °C per a un emmagatzematge a llarg termini.Eviteu la congelació-descongelació freqüent.
5) El producte és adequat per a RT-qPCR d'un sol pas, es recomana afegir 10-20 U de transcriptasa inversa per cada sistema de reacció de 25 μL o augmentar gradualment la quantitat de transcriptasa inversa segons la situació real.
Notes
1.Si us plau, mantingueu neta la zona experimental;S'han d'utilitzar guants i mascaretes nets durant el funcionament.Tots els consumibles utilitzats en l'experiment han de ser lliures de RNases per evitar la contaminació per RNases.
2.Tots els procediments s'han de realitzar sobre gel per evitar la degradació de l'ARN.
3.Es recomanen mostres d'ARN d'alta qualitat per garantir una alta eficiència de la transcripció inversa.
4.Aquest producte només és per a ús d'investigació.
5.Si us plau, opereu amb bates de laboratori i guants d'un sol ús, per a la vostra seguretat.
