M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
La transcriptasa inversa Neoscript és una transcriptasa inversa obtinguda mitjançant el cribratge de mutacions del gen M-MLV de l'origen i expressió del virus de la leucèmia murina Moloney a E.coli.L'enzim elimina l'activitat de la RNasa H, té una major tolerància a la temperatura i és adequat per a la transcripció inversa a alta temperatura.Per tant, és útil per eliminar els efectes desfavorables de l'estructura d'ARN d'alt nivell i factors no específics sobre la síntesi d'ADNc, i té una major estabilitat i capacitat de síntesi de transcripció inversa.L'enzim té una major estabilitat i capacitat de síntesi de transcripció inversa.
Components
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (opcional)
* 5 × First-Strand Buffer no conté dNTP, si us plau, afegiu dNTP quan prepareu el sistema de reacció
Aplicació recomanada
1.qRT-PCR d'un sol pas.
2.Detecció de virus ARN.
Condició d'emmagatzematge
-20 °C per a l'emmagatzematge a llarg termini, s'ha de barrejar bé abans d'utilitzar, evitar la congelació-descongelació freqüent.
Definició de la unitat
Una unitat incorpora 1 nmol de dTTP en 10 minuts a 37 °C utilitzant poli(A)•oligo(dT)25com a plantilla/imprimació.
Control de qualitat
1.Puresa electroforètica SDS-PAGE superior al 98%.
2.Sensibilitat d'amplificació, control de lot a lot, estabilitat.
3.No hi ha activitat nucleasa exògena, no hi ha contaminació amb endonucleases exògenes o exonucleases
Configuració de la reacció per a la primera solució de reacció en cadena
1.Preparació de la mescla de reacció
| Components | Volum |
| Oligo (dT)12-18 Primer o Random Primera O primers genètics específicsb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Plantilla RNA | ARN total≤ 5μg;ARNm ≤ 1 μg |
| dH lliure de RNasa2O | Fins a 10 μL |
Notes:a/b: seleccioneu diferents tipus d'imprimacions segons les vostres necessitats experimentals.
2.Escalfeu a 65 °C durant 5 minuts i refredeu ràpidament sobre gel durant 2 minuts.
3.Afegiu els components següents al sistema anterior a un volum total de 20 µl i barregeu suaument:
| Components | Volum (μL) |
| 5 × Tampó de primer fil | 4 |
| Transcriptasa inversa Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inhibidor de la RNasa (40 U/μL) | 1 |
| dH lliure de RNasa2O | Fins a 20 μL |
4. Realitzeu la reacció segons les condicions següents:
(1) Si s'utilitza Random Primer, la reacció s'ha de dur a terme a 25 ℃ durant 10 minuts, i després a 50 ℃ durant 30 ~ 60 minuts;
(2) Si s'utilitzen Oligo dT o imprimadors específics, la reacció s'ha de dur a terme a 50 ℃ durant 30 ~ 60 minuts.
5.Escalfeu a 95 ℃ durant 5 minuts per inactivar la transcriptasa inversa de Neoscript i acabar la reacció.
6.Els productes de transcripció inversa es poden utilitzar directament en la reacció PCR i la reacció PCR quantitativa de fluorescència, o emmagatzemar-se a -20 ℃ durant molt de temps.
PCR Racció:
1.Preparació de la mescla de reacció
| Components | Concentració |
| 10 × tampó PCR (sense dNTP, lliure de Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM cada dNTP) | 200 μM |
| 25 mM de MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA polimerasa (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Plantillaa | Solució de primera reacció en cadena ≤10% (2 μL) |
| ddH2O | Fins a 50 μL |
Notes:a: Si s'afegeix massa solució de la primera reacció en cadena, la reacció de PCR es pot inhibir.
2.Procediment de reacció de PCR
| Pas | Temperatura | Temps | Cicles |
| Pre-desnaturalització | 95℃ | 2-5 minuts | 1 |
| Desnaturalització | 95℃ | 10-20 segons | 30-40 |
| Recuit | 50-60 ℃ | 10-30 segons | |
| Extensió | 72℃ | 10-60 segons |
Notes
1.Adequat per a l'optimització de la temperatura de transcripció inversa en el rang de 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Té una millor estabilitat, és adequat per a l'amplificació de transcripció inversa a alta temperatura.A més, és favorable per passar de manera eficient per regions estructurals complexes de l'ARN.També, aixòés adequat per a la detecció quantitativa de RT-PCR de fluorescència múltiple d'un sol pas.
3.Bona compatibilitat amb diversos enzims d'amplificació de PCR i és adequat per a reaccions RT-PCR d'alta sensibilitat.
4.Adequat per a la reacció quantitativa RT-PCR de fluorescència d'un sol pas d'alta sensibilitat, millora eficaçment la taxa de detecció de baixa concentració de plantilles.
5.Apte per a la construcció de biblioteques d'ADNc.
