Enzima de captació del virus de la vacuna

L'enzim de captació del virus Vaccinia es deriva d'una soca recombinant d'E. coli que porta els gens per a l'enzim de captació de Vaccinia.Aquest únic enzim està format per dues subunitats (D1 i D12) i té tres activitats enzimàtiques (ARN trifosfatasa i guanililtransferasa per la subunitat D1 i guanina metiltransferasa per la subunitat D12).L'enzim de captació del virus Vaccinia és eficaç per catalitzar la formació de l'estructura de la tapa, que pot unir específicament l'estructura de la tapa de 7-metilguanilat (m7Gppp, Cap 0) a l'extrem 5' de l'ARN.L'estructura de la tapa (Cap 0) té un paper important en l'estabilització, el transport i la traducció de l'ARNm en eucariotes.Tapar l'ARN per reacció enzimàtica és un mètode eficaç i senzill que pot millorar significativament l'estabilitat i la traducció de l'ARN per a la transcripció, transfecció i microinjecció in vitro.

Components

Enzima de captació del virus de la vacuna (10 U/μL)

10 × Tampó de tapa

Condicions d'emmagatzematge

-25～- 15 ℃ per a l'emmagatzematge （Eviteu cicles de congelació-descongelació repetits）

Buffer d'emmagatzematge

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X- 100, 50% glicerol.

Definició de la unitat

Una unitat d'enzim de captació del virus Vaccinia es defineix com la quantitat d'enzim necessària per incorporar 10 pmol de GTP a una transcripció de 80 nt en 1 hora a 37 °C.

Control de qualitat

Exonucleasa:10U de l'enzim de captació del virus Vaccinia amb 1 μg d'ADN digerit λ-Hind III a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

Endonucleasa:10U de l'enzim de captació del virus Vaccinia amb 1 μg λDNA a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

Nickase:10U d'enzim de captació del virus Vaccinia amb 1 μg de pBR322 a 37 ℃ durant 16 hores no produeix degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

RNasa:10U d'enzim de captació del virus Vaccinia amb 1,6 μg d'ARN MS2 durant 4 hores a 37 ℃ no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

1.ADN coli:10U de l'enzim de captació del virus Vaccinia s'analitza per detectar la presència d'ADN genòmic d'E. coli mitjançant qPCR TaqMan amb cebadors específics per al locus rRNA 16S d'E. coli.La contaminació d'ADN genòmic d'E. coli és ≤1 genoma d'E. coli.

2.Bacterià Endotoxina: Prova LAL, segons l'edició 2020 de la Farmacopea Xinesa IV, mètode de prova de límit de gel, regla general (1143).El contingut d'endotoxines bacterianes ha de ser ≤10 EU/mg.

Sistema de reacció i condicions

1. Protocol de capping (volum de reacció: 20 μL)

Aquest procediment és aplicable a la reacció de captació de 10 μg d'ARN (≥100 nt) i es pot ampliar segons les demandes experimentals.

I) Combina 10 μg d'ARN i H2O lliure de nucleases en un tub de microcentrífuga d'1,5 ml fins a un volum final de 15,0 μL.*10 × Tampó de tapa: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Escalfeu a 65 ℃ durant 5 minuts seguit d'un bany de gel durant 5 minuts.

3) Afegiu els components següents en l'ordre especificat

* 10 × Tampó de tapa: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Incubeu a 37 ° C durant 30 minuts, l'ARN ara està tapat i llest per a aplicacions aigües avall.

2. Terminal de 5′ reacció d'etiquetatge (volum de reacció: 20 μl)

Aquest protocol està dissenyat per etiquetar l'ARN que conté un trifosfat de 5' i es pot ampliar segons les demandes.L'eficiència de la incorporació de l'etiqueta es veurà afectada per la proporció molar d'ARN: GTP, així com el contingut de GTP a les mostres d'ARN.

1) Combineu la quantitat adequada d'ARN i H2O lliure de nucleases en un tub de microcentrífuga d'1,5 ml fins a un volum final de 14,0 µL.

2) Escalfeu a 65 ℃ durant 5 minuts seguit d'un bany de gel durant 5 minuts.

3) Afegiu els components següents en l'ordre especificat.

** GTP MIX es refereix a GTP i un nombre reduït de marcadors.Per a la concentració de GTP, consulteua la nota 3.

4) Incubeu a 37 ° C durant 30 minuts, l'extrem de l'ARN 5′ ara està etiquetat i llest per a aigües avall

Aplicacions

1. Tapar l'ARNm abans dels assaigs de traducció/traducció in vitro

2. Etiquetatge de l'extrem 5' de l'ARNm

Notes sobre l'ús

1.L'escalfament de la solució d'ARN abans de la incubació amb l'enzim Vaccinia Capping elimina l'estructura secundària a l'extrem 5 de la transcripció.Amplieu el temps a 60 minuts per a les transcripcions amb 5'extrems coneguts altament estructurats.

2. L'ARN utilitzat per a les reaccions de tapa s'ha de purificar abans d'utilitzar-lo i suspès en aigua lliure de nucleases.L'EDTA no ha d'estar present i la solució ha d'estar lliure de sals.

3. Per marcar l'extrem 5´, la concentració total de GTP hauria d'estar al voltant d'1-3 vegades la concentració molar d'ARNm a la reacció.

4. El volum del sistema de reacció es pot augmentar o reduir segons el real.