PNGase F
El pèptid-N-glicosidasa F (PNGasa F) és el mètode enzimàtic més eficaç per eliminar gairebé tots els oligosacàrids N-enllaçats de les glicoproteïnes.La PNGasa F és una amidasa, que s'escindeix entre els residus més interns de GlcNAc i asparagina d'oligosacàrids híbrids i complexos d'alta manosa de glicoproteïnes lligades a N.
Aplicació
Aquest enzim és útil per eliminar els residus d'hidrats de carboni de les proteïnes.
Preparació i especificació
| Aparença | Líquid incolor |
| Puresa de proteïnes | ≥95% (de SDS-PAGE) |
| Activitat | ≥500.000 U/ml |
| Exoglicosidasa | No s'ha pogut detectar cap activitat (ND) |
| Endoglicosidasa F1 | ND |
| Endoglicosidasa F2 | ND |
| Endoglicosidasa F3 | ND |
| Endoglicosidasa H | ND |
| Proteasa | ND |
Propietats
| Número CE | 3.5.1.52(Recombinant a partir de microorganismes) |
| Pes molecular | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Punt isoelèctric | 8. 14 |
| pH òptim | 7,0-8,0 |
| Temperatura òptima | 65 °C |
| Especificitat del substrat | Escindir enllaços glicosídics entre GlcNAc i residus d'asparagina Fig.1 |
| Llocs de reconeixement | Glicans lligats a N tret que continguin α1-3 fucosa Fig. 2 |
| Activadors | TDT |
| Inhibidor | SDS |
| Temperatura del magatzem | -25 ~ -15 ℃ |
| Inactivació per calor | Una barreja de reacció de 20 µL que conté 1 µL de PNGasa F s'inactiva mitjançant la incubació a 75 °C durant 10 minuts. |
Fig. 1 Especificitat del substrat de PNGasa F
Fig. 2 Llocs de reconeixement de PNGase F.
Quan els residus interns de GlcNAc estan units a la fucosa α1-3, la PNGasa F no pot escindir els oligosacàrids lligats a N de les glicoproteïnes.Aquesta modificació és freqüent en plantes i algunes glicoproteïnes d'insectes.
Coponents
|
| Components | Concentració |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Tampó desnaturalitzador de glicoproteïna | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definició de la unitat
Una unitat (U) es defineix com la quantitat d'enzim necessària per eliminar > 95% dels hidrats de carboni de 10 µg de RNasa B desnaturalitzada en 1 hora a 37 °C en un volum de reacció total de 10 µL.
Condicions de reacció
1.Dissoleu 1-20 µg de glicoproteïna amb aigua desionitzada, afegiu 1 µl de tampó de desnaturalització de glicoproteïnes 10× i H2O (si cal) per obtenir un volum de reacció total de 10 µl.
2.Incubar a 100 °C durant 10 minuts, refredar-lo amb gel.
3.Afegiu 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 i barregeu-ho.
4.Afegiu 1-2 µl de PNGasa F i H2O (si cal) per fer un volum de reacció total de 20 µl i barrejar.
5.Incubar la reacció a 37 °C durant 60 min.
6.Per a anàlisi SDS-PAGE o anàlisi HPLC.
