ARNm Cap2'-O-metiltransferasa

L'ARNm Cap 2' -O-metiltransferasa es va derivar d'una soca recombinant d'E. coli que porta el gen de l'ARNm de vaccinia Cap 2'-O-metiltransferasa.Aquest enzim afegeix un grup metil a la posició 2'-O del primer nucleòtid adjacent a l'estructura de la tapa a l'extrem 5' de l'ARN. L'enzim utilitza S-adenosilmetionina (SAM) com a donant de metil per metilar l'ARN tapat (tapa). -0) resultant en una estructura cap- 1.

L'estructura Cap1 pot augmentar l'eficiència de la traducció, millorant l'expressió de l'ARNm en experiments de transfecció i microinjecció. Aquest enzim requereix específicament ARN amb una tapa m7GpppN com a substrat.No pot utilitzar ARN amb pN, ppN, pppN o GpppN a l'extrem 5'.L'ARN tapat es pot preparar mitjançant la transcripció in vitro mitjançant un anàleg de tapa o mitjançant un tap enzimàtic mitjançant l'enzim Vaccinia Capping Enzyme.

Components

mRNA Cap 2'-O-metiltransferasa (50U/μL)

10 × Tampó de reacció de tapa

Emmagatzematge

-25 ～- 15 ℃ per a l'emmagatzematge （Eviteu cicles repetits de congelació-descongelació）

Buffer d'emmagatzematge

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0, 25 ℃), NaCl 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 al 0,1%, glicerol al 50%.

Definició de la unitat

Una unitat es defineix com la quantitat d'enzim necessària per metilar 10 pmols de transcripció d'ARN amb tapa de 80 nt en 1 hora a 37 °C.

Assajos de control de qualitat

Exonucleasa: 50U d'ARNm Cap 2' -O-metiltransferasa amb 1 μg d'ADN digerit λ-Hind III a 37 ℃ durant 16 hores no produeix degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

Endonucleasa: 50 U d'ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferasa amb 1 μg de λDNA a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

Nickase: 50U d'ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferasa amb 1 μg de pBR322 a 37 ℃ durant 16 hores no produeixen degradació tal com es determina per electroforesi en gel d'agarosa.

RNasa: 50U d'ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferasa amb 1,6 μg d'ARN MS2 durant 4 hores a 37 ℃ no produeix degradació tal com determina l'electroforesi en gel d'agarosa.

E. coli ADN: 50U d'ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferasa s'examinen per a la presència deE. coli ADN genòmic utilitzant TaqMan qPCR amb cebadors específics per aE. coli locus de l'ARNr 16S.ElE. coli La contaminació de l'ADN genòmic és =1E. coli genoma.

Bacterià Endotoxina: prova LAL, segons l'edició 2020 de la Farmacopea Xinesa IV, mètode de prova de límit de gel, regla general (1143).El contingut d'endotoxines bacterianes hauria de ser = 10 EU/mg.

Sistema de reacció i condicions

1. Combineu una quantitat adequada d'ARN tapat i H2O lliure de RNasa en un tub de microcentrífuga d'1,5 ml fins a un volum final de 16,0 µL.

2. Escalfeu a 65 ℃ durant 5 minuts seguit d'un bany de gel durant 5 minuts.

3. Afegiu els components següents en l'ordre especificat (per a la metilació de l'ARN encapsulat

menys de 10

* 10 × Tampó de reacció de tapa: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Incubeu a 37 ℃ durant 1 hora (es recomana 2 hores d'incubació per al fragment objectiu de menys de 200 nt).

Aplicacions

Millorar l'expressió d'ARNm durant els experiments de microinjecció i transfecció.

Notes sobre l'ús

1. Abans de la reacció, l'ARN s'ha de purificar i dissoldre en aigua sense nucleases, totes les solucions no han de contenir EDTA ni ions.

2. Es recomana escalfar l'ARN de la mostra a 65 ℃ durant 5 minuts abans de la reacció per eliminar l'estructura secundària a l'extrem 5 de la transcripció.Es podria ampliar a 10 min per a l'estructura complexa de terminals de 5'.