KIT ELISA d'ARN de doble cadena (ARNds).

Aquest kit és un acoblament d'assaig immunosorbent vinculat a enzims (ELISA) amb un sistema biotina-estreptavidina, per a la mesura quantitativa d'ARNdb amb una longitud superior a 60 parells de bases (pb), independentment de la seqüència.La placa s'ha recobert prèviament amb anticossos anti-dsRNA.S'afegeix dsRNA present a la mostra i s'uneix als anticossos recoberts als pous.A continuació, s'afegeix un anticòs anti-dsRNA biotinilat i s'uneix al dsRNA de la mostra.Després del rentat, s'afegeix HRP-Streptavidina i s'uneix a l'anticòs anti-dsRNA biotinilat.Després de la incubació, l'HRP-streptavidina no lligada es renta.A continuació, s'afegeix una solució de substrat TMB i la catalitza HRP per produir un producte de color blau que es va convertir en groc després d'afegir una solució de parada àcida.La densitat del groc és proporcional a la quantitat objectiu de dsRNA capturat a la placa.L'absorbància es mesura a 450 nm.

Aplicació

Aquest kit és per a la mesura quantitativa del dsRNA residual.

Components del kit

Emmagatzematge i estabilitat

1. Per al kit no utilitzat: tot el kit es pot emmagatzemar a 2~8 ℃ durant la vida útil.S'ha d'evitar la llum forta per a l'estabilitat de l'emmagatzematge.

2. Per al kit usat: un cop oberta la microplaca, tapeu els pous no utilitzats amb un segellador de plaques i torneu a la bossa d'alumini que conté el paquet dessecant, tanqueu amb cremallera la bossa d'alumini i torneu a 2 ~ 8 ℃ tan aviat com sigui possible després de l'ús.Els altres reactius s'han de tornar a 2 ~ 8 ℃ tan aviat com sigui possible després de l'ús.

Materials necessaris però no subministrats

1. Lector de microplaques amb filtre de 450±10nm (millor si es pot detectar a 450 i 650 nm de longitud d'ona).

2. Agitador de microplaques.

3. Puntas i tubs de centrífuga sense RNases.

Diagrama de flux d'operacions

Abans que comencis

1. Porteu tots els components i mostres del kit a temperatura ambient (18-25 ℃) abans d'utilitzar-los.Si el kit no s'utilitzarà en una sola vegada, traieu només tires i reactius per al present experiment i deixeu les tires i reactius restants en les condicions necessàries.

2. Tampó de rentat: diluïu 40 mL de tampó de rentat 20× concentrat amb 760 mL d'aigua desionitzada o destil·lada per preparar 800 mL de tampó de rentat 1×.

3. Estàndard: centrifuga o centrifuga breument la solució d'emmagatzematge abans d'utilitzar-la.La concentració de quatre estàndards proporcionats és de 5 ng/μL.Per als estàndards dsRNA UTP i pUTP, diluïu la solució d'estoc a 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL amb tampó STE per dibuixar la corba estàndard.Per als estàndards dsRNA N1-Me-pUTP, diluïu la solució d'estoc a 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL amb tampó STE per dibuixar la corba estàndard.Per a l'estàndard dsRNA 5-OMe-UTP, diluïu la solució d'estoc a 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL amb tampó STE per dibuixar la corba estàndard.Recomanem que els estàndards es puguin diluir com els següents gràfics:

4. Anticòs de detecció biotinilats i solució de treball HRP-estreptavidina: centrifuga o centrifuga breument la solució d'emmagatzematge abans d'utilitzar-la.Dilueix-los a la concentració de treball amb tampó de dilució.

5. Subestat TMB: aspirar la dosi necessària de la solució amb puntes esterilitzades i no tornar a abocar la solució residual al vial.El subestat de TMB és sensible a la llum, no exposis el substrat de TMB a la llum durant molt de temps.

Ús del protocol

1. Determineu el nombre de tires necessàries per a l'assaig.Inseriu les tires als marcs per utilitzar-les.Les tires de plaques restants que no s'utilitzen en aquest assaig s'han de tornar a empaquetar a la bossa amb dessecant.Tanqueu bé la bossa per a l'emmagatzematge refrigerat.

2. Afegiu 100μL cadascuna de les dilucions de l'estàndard, el blanc i les mostres als pous adequats.Cobrir amb el segellador de plaques.Incubar durant 1 hora a temperatura ambient amb agitació a 500 rpm.Les mostres s'han de diluir amb tampó STE a la concentració adequada per a un assaig precís.

3. Pas de rentat: Aspirar la solució i rentar amb 250μL de tampó de rentat a cada pou i deixar reposar 30 segons.Descarteu completament el tampó de rentat enganxant la placa sobre paper absorbent.Rentar totalment 4 vegades.

4. Afegiu 100μL de solució de treball d'anticossos de detecció biotinilats a cada pou.Cobrir amb el segellador de plaques.Incubar durant 1 hora a temperatura ambient amb agitació a 500 rpm.

5. Repetiu el pas de rentat.

6. Afegiu 100μL de solució de treball HRP-estreptavidina a cada pou.Cobrir amb el segellador de plaques.Incubar durant 30 minuts a temperatura ambient amb agitació a 500 rpm.

7. Repetiu el pas de rentat de nou.

8. Afegiu 100μL de solució de substrat TMB a cada pou.Cobrir amb el segellador de plaques.Incubar durant 30 min a TA Protegir de la llum.El líquid es tornarà blau afegint una solució de substrat.

9. Afegiu 50μL de solució de parada a cada pou.El líquid es tornarà groc per l'addició de la solució de parada.A continuació, executeu el lector de microplaques i feu la mesura a 450 nm immediatament.

Càlcul de resultats

1. Feu una mitjana de les lectures duplicades per a cada estàndard, control i mostres i resteu la densitat òptica estàndard zero mitjana.Construeix una corba estàndard amb absorbància a l'eix vertical (Y) i concentració dsRNA a l'eix horitzontal (X).

2. Es recomana realitzar el càlcul amb un programari d'ajustament de corbes basat en ordinador com Curve Expert 1.3 o ELISA Calc en un model d'ajust no lineal de 5 o 4 paràmetres.

Rendiment

1. Sensibilitat:

límit inferior de detecció: ≤ 0,001 pg/μL (per a UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (per a 5-OMe-UTP-dsRNA).

límit inferior de quantificació: 0,0156 pg/μL (per a UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (per a N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (per a 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precisió: CV d'Intra-assaig ≤10%, CV de Inter-assaig ≤10%

3. Recuperació: 80% ~ 120%

4.Linealitat: 0,0156-0,5 pg/μL (per a UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (per a N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (per a 5-OMe-UTP-dsRNA).

Consideracions

1. La temperatura i el temps de reacció de TMB són crítics, controleu-los estrictament segons les instruccions.

2. Per aconseguir una bona reproductibilitat i sensibilitat de l'assaig, és essencial un rentat adequat de les plaques per eliminar l'excés de reactius que no han reaccionat.

3. Tots els reactius s'han de barrejar bé abans d'utilitzar-los i evitar que es facin enfonsaments durant l'addició de mostres o reactius.

4. Si s'han format cristalls al tampó de rentat concentrat (20x), escalfeu-lo a 37 ℃ i barregeu suaument fins que els cristalls es dissolguin completament.

5. Eviteu l'assaig de mostres que contenen azida de sodi (NaN3), ja que podria destruir l'activitat de l'HRP i, per tant, una subestimació de la quantitat d'ARNdb.

6. Eviteu la contaminació de la RNasa durant l'assaig.

7. L'estàndard/mostra, l'anticossos de detecció i el SA-HRP també es poden dur a terme a RT sense sacsejar, però això pot provocar que la sensibilitat de detecció disminueixi una vegada.Per a aquest cas, recomanem que els estàndards dsRNA UTP i pUTP s'hagin de diluir a partir de 2 pg/μL, els estàndards dsRNA N1-Me-pUTP s'haurien de diluir des de 4pg/μL i l'estàndard dsRNA 5-OMe-UTP s'hauria de diluir des de 8pg/μL.A més, incubeu la solució de treball HRP-estreptavidina durant 60 minuts a temperatura ambient.No utilitzeu l'agitador de matràs, ja que l'agitador de matràs pot provocar un resultat inexact.

Resultat típic

1. Dades de la corba estàndard

2. Càlcul de corbes estàndard

3. Interval de detecció del revestiment: 0,0312- 1pg/μL